Was vom Barcode-Versprechen blieb

Am Anfang steht eine scheinbar simple Frage: Welche Art ist das? Ein großer Teil der biologischen Forschung hängt an solchen Artdiagnosen, doch die taxonomische Expertise, die sie liefert, bricht weg. Biologen haben es mit einem Planeten zu tun, der von Millionen Arten bevölkert ist. Nur wenige Taxonomen aber können mehr als 0,01 Prozent der geschätzten Artenzahl kritisch bestimmen. Vor diesem Hintergrund fiel 2003 der Begriff DNA-Barcode für eine globale Artbestimmung, geprägt von Hebert.

Der Vorschlag dahinter ist so schlicht wie folgenreich: Systeme, die DNA-Sequenzen als Barcodes eines Taxons verwenden. Das Papier hält fest, dass das mitochondriale Gen der Cytochrom-c-Oxidase I, kurz COI, als Kern eines globalen Bioidentifikationssystems für Tiere dienen kann. Dass die Wahl auf das Erbgut der Mitochondrien fiel und nicht auf den Zellkern, hat handfeste Gründe: Diesem Genom fehlen Introns, und der Rekombination ist es nur begrenzt ausgesetzt. Innerhalb des mitochondrialen Genoms hat ausgerechnet COI zwei wichtige Vorteile. Die universellen Primer für dieses Gen sind sehr robust und greifen bei Vertretern der meisten, wenn nicht aller Tierstämme.

Ein Versprechen ist das eine, ein Nachweis das andere. Die Arbeit prüfte deshalb gleich, was COI als taxonomisches Werkzeug leisten kann. Ein erstes Profil deckte die sieben artenreichsten Tierstämme ab, gestützt auf die Analyse von 100 repräsentativen Arten. Dieses schmale Grundgerüst ordnete 96 Prozent der neu analysierten Taxa dem richtigen Stamm zu. Enger wurde es eine Ebene tiefer, bei den Arten selbst. Ein Modellprofil stützte sich auf je ein Individuum von 200 nah verwandten Schmetterlingsarten. Es identifizierte die anschließend untersuchten Exemplare zu 100 Prozent korrekt.

Dass ein solcher Abgleich überhaupt funktionieren kann, steht und fällt mit einer Annahme, der Barcode-Lücke: Die innerartliche Variabilität muss einen geringeren Wert einnehmen als die zwischenartliche. Die Messungen zeichneten genau dieses Bild. Die Abstände zwischen Individuen derselben Art blieben stets klein und lagen im Mittel bei 0,25 Prozent. Zwischen Arten derselben Gattung dagegen betrugen sie im Durchschnitt 6,8 Prozent und fielen bei entfernter verwandten Taxa noch höher aus. Damit stand ein Versprechen im Raum: ein COI-Identifikationssystem, das eine verlässliche, kostengünstige und zugängliche Lösung liefern würde.

Die Bestimmung einer Art war immer schon eine zentrale Herausforderung der biologischen Forschung — eine Aufgabe, die sich auf das Können der internationalen taxonomischen Gemeinschaft stützte. Wo diese Fachleute fehlen, stockt die Arbeit: Der Mangel an ausgebildeten Taxonomen und Kuratoren ist der eigentliche Flaschenhals. Im Fach trägt er einen eigenen Namen, das taxonomische Hemmnis, und gilt als international anerkanntes Problem. DNA-Barcoding trat als alternativer Ansatz an, der eine beschleunigte Erfassung des Artenreichtums für alle Tiergruppen zu weit geringeren Kosten erlauben sollte.

Wie eng der Engpass sein kann, zeigt ein Blick nach Deutschland, ein Land mit einer über 200 Jahre alten taxonomischen Forschungstradition. Für die deutsche Checkliste der Hautflügler standen 32 Spezialisten für 247 Grabwespenarten zur Verfügung; für die Schlupfwespen dagegen musste ein einziger Spezialist 3.332 Arten bearbeiten. Ein solches Missverhältnis lässt sich durch Fleiß nicht ausgleichen. Es trifft ausgerechnet die artenreichen, schwierigen Gruppen, denn die Spezialisten haben sich überwiegend auf weniger vielfältige und leichter zu untersuchende Organismen konzentriert.

Was es kosten würde, die Inventur trotzdem auf dem alten Weg zu Ende zu bringen, ist durchgerechnet worden. Eine vollständige Erfassung aller Tierarten mit morphologischen Mitteln würde 250 Milliarden Dollar und weitere 600 Jahre verschlingen. Dem steht die Schätzung für ein weltweites Barcode-Programm gegenüber: rund 500 Millionen Dollar. Fünfhundert Millionen gegen 250 Milliarden — das ist ein Fünfhundertstel der Summe, rund zwei Promille.

Der Abstand rührt vom Verfahren selbst her. Ein molekularer Marker ermöglicht die Bestimmung aller Entwicklungsstufen von Organismen und ebenso die von Organismus-Fragmenten, und er lässt sich unter Zuhilfenahme von Automatisierungsprozessen betreiben. Das Tempo ist dabei längst keine Projektion mehr: Das kanadische Barcoding-Zentrum verarbeitet inzwischen eine Million Proben pro Jahr.

Wie weit das trägt, zeigt die Bilanz des ersten großen Programms. Bis 2015 hatte es DNA-Barcodes für 500.000 Arten geliefert, abgelegt in der Online-Datenbank Barcode of Life Data System. Diese standardisierten Referenzsequenzen sind für Forschende überall zu einem Werkzeug der schnellen Artbestimmung geworden. Die Zusage, Tempo gegen den Spezialistenmangel zu setzen, ist damit weitgehend eingelöst: DNA-Barcoding hat Ansätze und Erwartungen rund um den Nachweis und die Diagnose von Arten bereits umgewälzt.

Die Befürworter des Barcodings erwarten eine Lücke zwischen zwei Größen: der Variation innerhalb einer Art und der Divergenz zwischen zwei Arten. In der Praxis wird daraus eine Zahl, denn die Artabgrenzung stützt sich auf Schwellenwerte, die zwischen innerartlicher Variation und zwischenartlicher Divergenz trennen sollen. Eine solche Schwelle kann auf zwei Weisen irren. Sie zerteilt eine Art, deren innere Variation tiefer reicht als der Schwellenwert, und sie wirft Arten zusammen, deren Abstand voneinander flacher ausfällt als der angesetzte Wert.

Wie sauber die Lücke im Idealfall liegt, zeigt eine Fallstudie an Königinnen von fünf nah verwandten Hummel-Taxa. Zwischen den Taxa unterscheiden sich die COI-Sequenzen um rund 30 bis 60 Basensubstitutionen. Innerhalb eines Taxons liegt die Variation dagegen nur bei ein bis sechs Substitutionen — genau die Lücke, auf der Barcoding beruht. Die Gruppen sind dort klar getrennt, mit geringer Variabilität und ohne Überlappung.

Was aber, wenn eine Gruppe besonders dicht beprobt wird? Meyer und Paulay prüften das Verfahren an einer vollständig beprobten, vielgestaltigen Gruppe mariner Schnecken, den Kaurischnecken. Statt der erwarteten Barcode-Lücke fanden sie eine breite Überlappung mit rund 17 Prozent Mindestfehler. Für die bloße Zuordnung einer Probe zu einem gut bekannten Stammbaum lag der niedrigste Gesamtfehler dagegen bei vier Prozent.

Der Unterschied zu den früheren, optimistischen Befunden liegt nicht bei den Tiergruppen, sondern beim Sammeln. Die früher berichtete Barcode-Lücke erklärt sich laut den Autoren durch zu dünn beprobte Schwesterarten. Die gemeldete Lücke ist damit der günstigste Fall und kann mit dichterer Beprobung innerhalb wie zwischen den Arten nur schrumpfen oder verschwinden.

Daraus ziehen die Autoren einen unmissverständlichen Schluss: Schwellenwerte zur Artabgrenzung werden ausdrücklich nicht empfohlen. Ein solcher Grenzwert übersieht nach ihren Daten mindestens ein Fünftel der Lebensformen, die eigenständig, aber weniger stark divergent sind. Denn die Überlappung zwischen inner- und zwischenartlichen Unterschieden dürfte in den meisten großen Verwandtschaftsgruppen erheblich sein.

Eine Referenzbibliothek für das Leben auf der Erde ist ein Versprechen mit zwei Hälften. Sie muss wachsen, und man muss ihr trauen können. Wie weit ist das internationale Barcode-Konsortium mit beidem gekommen? Bis 2015 hatte sein erstes Forschungsprogramm BARCODE 500K DNA-Barcodes für 500.000 Arten geliefert, zugänglich über die Online-Datenbank BOLD. Dahinter stand ein Aufwand von 125 Millionen Dollar für die Barcode-Abdeckung dieser 500.000 Arten.

Eine Bibliothek misst sich aber nicht allein an der Zahl der Arten. 2016 enthielt die Datenbank bereits mehr als 4,2 Millionen validierte Barcodes. Gepflegt wird diese Bibliothek als BOLD Systems vom Centre for Biodiversity Genomics im kanadischen Guelph. Offen stehen soll sie allen. Schon die deutsche Initiative GBOL zog aus ihrer ersten Phase den Schluss, dass nach der Validierung alle Daten über BOLD online veröffentlicht werden sollten, damit auch externe Nutzer darin suchen können.

Ob eine solche Bibliothek hält, was sie verspricht, entscheidet sich an ihrer Kuration. BOLD ist eine Werkbank, und seine taxonomische Übersicht umfasst veröffentlichte wie unveröffentlichte Einträge. Nutzer stoßen deshalb auf widersprüchliche taxonomische Zuordnungen, besonders unter den unveröffentlichten Einträgen.

Genau hier setzt eine Prüfung an, die die Bestimmungs-Suchmaschine von BOLD mit Anfragesequenzen aus einem kuratierten Datensatz zur Zweiflügler-Gattung Tachina getestet hat. Die von der BOLD-v4-Suchmaschine vorgeschlagenen Arten wichen dabei mitunter von den Referenz-BINs ab. Die Suchmaschine nannte Arttreffer auch dann, wenn dafür keine morphologisch bestimmten Belege vorlagen. Einträge, die einem BIN ohne Artzuordnung zugewiesen waren, lieferten umgekehrt gar kein Ergebnis.

Die Prüfer fordern deshalb unter anderem die verpflichtende Dokumentation der Bestimmungsmethode. Ein Teil der Empfehlungen ist in BOLD v5 bereits berücksichtigt, dessen Standardmodus nur noch öffentliche Daten verwendet. Eine Bibliothek für alle ist damit nicht nur eine Frage ihrer Größe, sondern der Frage, wie nachvollziehbar jeder einzelne Eintrag zustande gekommen ist.

Bei Tieren war die Rechnung aufgegangen: Die großflächige, standardisierte Sequenzierung des mitochondrialen Gens CO1 machte das DNA-Barcoding in vielen Tiergruppen zu einem effizienten Werkzeug der Artbestimmung. Im Pflanzenreich scheiterte genau dieses Rezept: Die niedrigen Substitutionsraten der Mitochondrien-DNA führten dort zur Suche nach alternativen Barcode-Regionen. Fündig wurde man in einem anderen Zellorganell, denn die brauchbaren genetischen Marker der Pflanzen liegen gewöhnlich im Chloroplasten-Genom.

Aus den ersten Untersuchungen dieser Plastiden-Regionen gingen sieben führende Kandidaten hervor: vier Abschnitte aus codierenden Genen und drei nichtcodierende Spacer. Verschiedene Forschungsgruppen schlugen verschiedene Kombinationen dieser Loci als ihren bevorzugten Pflanzen-Barcode vor, doch ein Konsens entstand nicht. Dieser fehlende Standard bremste den Fortschritt beim Pflanzen-Barcoding. Am Ende stand ein Kompromiss, auf den sich die Fachgemeinschaft breit einigen konnte: rbcL und matK gemeinsam, als Standard-Barcode aus zwei Loci. Geprüft wurde diese Kombination an insgesamt 907 Proben aus 550 Arten quer durch die Landpflanzen.

Die Bilanz fiel gemischt aus: Die eindeutige Bestimmung bis auf die Artebene gelang in 72 Prozent der Fälle. Die übrigen Proben ließen sich nur noch Gruppen nahe verwandter Arten derselben Gattung zuordnen. Aus dem Versprechen eines einzigen Markers war damit ein Markersatz geworden, und aus der Art in vielen Fällen nur eine Artengruppe.

Wie eng diese Grenze gezogen ist, zeigt sich, sobald gezielt nah verwandte Arten derselben Gattung verglichen werden: Dann wies keiner der geprüften Barcodes mehr eine große Lücke zwischen der Variation innerhalb einer Art und dem Abstand zwischen den Arten auf. Besonders schwer zu unterscheiden sind Gruppen, die sich erst vor kurzem aufgefächert haben oder langsam mutieren. Aus der Heilpflanzenforschung kam ein Gegenvorschlag: ITS2 bestimmte 92,7 Prozent der Proben korrekt auf Artebene und 99,8 Prozent auf Gattungsebene.

Ein Teil der Schwäche ist bauartbedingt, denn Plastiden-Barcodes tragen eine eingebaute Grenze, wenn es um das Nachzeichnen von Artgrenzen geht. Der Bestimmungserfolg pflanzlicher Barcodes bleibt damit niedriger als der in vielen Tiergruppen. Für zahlreiche Anwendungen sind die Pflanzen-Barcodes dennoch ausgesprochen brauchbar.

Arten nachweisen, ohne sie zu sehen oder zu fangen: Metabarcoding kann einige der Schwierigkeiten klassischer Erhebungsmethoden umgehen, darunter die zeitaufwendige morphologische Bestimmung. Das Verfahren nutzt die Hochdurchsatz-Sequenzierung taxonomisch aussagekräftiger Barcoding-Gene, um die Taxa zu bestimmen, die in einer gemischten Probe stecken. Angewendet wird es meist auf DNA aus Umweltproben wie Wasser, Boden oder Sediment, die sogenannte Umwelt-DNA oder eDNA. Der Bedarf an effizienten Überwachungsmethoden wächst. eDNA-Metabarcoding gilt als leistungsfähiger und kostengünstiger Kandidat, um darauf zu antworten.

Wie weit die Fläche reicht, zeigen die Anwendungen. Blutsaugende Blutegel lieferten das Material, um die Wirbeltierfauna eines 677 Quadratkilometer großen Naturschutzgebiets in China zu kartieren. In einer österreichischen Fallstudie wurden insgesamt 14 Fischarten nachgewiesen, während die qualitativen Elektrobefischungen nur neun nachweisen konnten. Bei Amphibien in verschiedenen aquatischen Systemen lag die Zahl der per eDNA-Metabarcoding nachgewiesenen Arten gleich hoch oder höher als bei konventionellen Methoden. Dazu kommt eine breite taxonomische Abdeckung zu vergleichsweise geringen Kosten.

Der Preis dafür steht in der Statistik. Das Potenzial DNA-gestützter Erhebungen für Monitoring und Management der Biodiversität geht mit einer Reihe statistischer Herausforderungen einher. In einer Studie an archiviertem Schwebstoff fanden die Autoren innerhalb der Probenstellen eine hohe Zufälligkeit im Artnachweis über alle Replikate hinweg. Das ist kein Randeffekt, sondern der Grund für ihre Empfehlung: Sie raten zu mindestens acht Replikaten für Biodiversitätserhebungen mit Schwebstoff. Bei Mengenangaben stößt die Methode an eine Grenze. Aus Metabarcoding-Daten allein lassen sich keine absoluten Werte artspezifischer Biomasse über Standorte hinweg bestimmen. Ableiten lässt sich nur die Veränderung artspezifischer Biomasse zwischen Standorten. Die Schwierigkeiten einer genauen Abschätzung von Häufigkeiten rühren aus mehreren Faktoren im Feld und im Labor. Entsprechend sind eDNA-Signale nicht immer eng an die lokale ökologische Dynamik gekoppelt.

Das ist kein Einwand gegen die Methode, sondern eine Bauanleitung für ihren Einsatz. Fehler und Unsicherheiten solcher Studien lassen sich oft durch durchdachtes Studiendesign und eine passende Primerwahl abmildern. Für das kommende Jahrzehnt wird erwartet, dass eDNA-Metabarcoding von Tieren und Pflanzen zu einem Standardwerkzeug der Erhebung wird, das konventionelle Methoden ergänzt.

Die Strafverfolgung beobachtet seit einigen Jahren wachsende Verbindungen zwischen Wildtierkriminalität und organisiertem Verbrechen. Der illegale Handel mit Tieren und Pflanzen wirft Gewinne ab, die mit denen des Drogenhandels vergleichbar sind, bei nur einem Bruchteil des Risikos. Wo Ware mit einem Etikett unterwegs ist, das niemand im Vorbeigehen überprüfen kann, wird die schlichte Frage, welche Art hier eigentlich vorliegt, zu einer Frage mit Folgen.

Wie oft die Antwort auf dem Etikett falsch ist, zeigte eine europaweite Stichprobe aus der Gastronomie. Untersucht wurden Fischproben, die in 180 Großküchen-Betrieben in 23 europäischen Ländern gesammelt wurden. Das Barcoding ergab, dass 26 Prozent der Proben falsch etikettiert waren. Am höchsten lag die Quote in Spanien, Island, Finnland und Deutschland; in Schweden, der Schweiz und der Slowakei fand sich dagegen kein einziger Fall. Untergeschoben wurde dabei meist billigerer Fisch.

Auch im Regal wird die Methode fündig. Von den handelsüblichen Präparaten der Traubensilberkerze, eines pflanzlichen Nahrungsergänzungsmittels, enthielt über ein Viertel nicht die nordamerikanische Zielart, sondern asiatische Verwandte als Ersatz. Für den Zoll geht es dabei um eine große Zahl: Rund 29.000 Pflanzenarten stehen unter dem Schutz des Artenschutzabkommens CITES, und sie von nicht geschützten Arten zu unterscheiden, ist eine eigene Aufgabe.

Handfest heißt allerdings nicht automatisch eindeutig. Ein Treffer entsteht, indem die unbekannte Sequenz mit denen bekannter Proben verglichen wird. Bei gut dokumentierten Arten kommt dabei häufig eine hundertprozentige Übereinstimmung heraus, während nah verwandte Arten einander ohnehin zu 90 bis 95 Prozent ähneln. Wie schwer ein solcher Treffer als Beweis wiegt, bleibt damit der Erfahrung und dem Urteil des Forensikers überlassen.

Und manchmal richtet die Methode grundsätzlich nichts aus. Behauptet ein Händler, ein Tier stamme nicht aus der Wildnis, sondern aus einer Nachzucht, verwischt sich die Spur, weil in beiden Regionen dieselben genetischen Marker vorkommen. Ohne Vergleichsproben der Elterntiere ist es dann nicht möglich, die beiden Möglichkeiten mit DNA-Markern auseinanderzuhalten. Weiter helfen an dieser Stelle nur andere Spuren, etwa Umweltmarker wie stabile Isotope, die den Ort widerspiegeln, an dem das Tier gelebt hat.

Ein mitochondrialer Marker misst nur dann, was er messen soll, wenn die abgelesene Sequenz auch wirklich aus dem Mitochondrium des untersuchten Tieres stammt. Diese Annahme hält nicht immer. Zu den bekannten Störfaktoren zählen introgressive Hybridisierungen und intrazelluläre Endosymbionten, die zu einer Verfälschung der mitochondrialen Variabilität führen können.

Der erste Störfaktor ist eine Art Geisterkopie. Stücke mitochondrialer DNA sind ins Kerngenom eingewandert und liegen dort als Numts vor; was dann wie mitochondriale Variation aussieht, ist keine mitochondriale Variation, sondern ein nukleäres Pseudogen. Numts sind ein Hauptproblem bei der Nutzung der Mitochondrien für solche Bestimmungszwecke. Bei Gliederfüßern zeigte sich, dass DNA-Barcoding die Artenzahl überschätzt, wenn Numts mitamplifiziert werden. Auch die Amplifizierung selbst können sie erheblich stören.

Trennen lassen sich die beiden Kopien nur mit Aufwand, denn das mitochondriale Genom ist ringförmig und rekombiniert nicht. In einer Untersuchung an asiatischen Scharnierschildkröten setzten die Autoren dafür Long-Range-PCR ein, um mitochondriale Kopien von Numts zu unterscheiden. Bei zwei Tieren zeigten die Chromatogramme an mehreren Positionen Doppelsignale, die auf Numts hindeuteten. Weil sich die echten mitochondrialen Orthologe nicht mit Sicherheit bestimmen ließen, mussten diese beiden Tiere aus der Analyse fliegen.

Der zweite Störfaktor ist ein Bakterium. Wolbachia ist eine Gattung bakterieller Endosymbionten, die in die Fortpflanzungssysteme ihrer Wirte eingreift. Weil das Bakterium die Vererbungswege der Mitochondrien beeinflusst, kann Wolbachia die Muster mitochondrialer Variation und damit auch die DNA-Barcodes verwirren. Das kann in zwei Richtungen schiefgehen. Entweder werden mehr Linien als neue oder verschiedene Arten markiert, als tatsächlich vorhanden sind. Oder eine Infektion fegt umgekehrt die mitochondriale Variation zwischen Arten weg.

Dagegen steht ein Befund aus der Datenbankpraxis. Als mehr als zwei Millionen Insekten-COI-Trace-Files im Barcode of Life Datasystem geprüft wurden, war Wolbachia-COI in 0,16 Prozent der Fälle vorhanden. Der bakterielle Abschnitt wurde dabei nie mit dem COI des Wirts verwechselt. Das Fazit der Autoren lautet, dass Insekten-Barcoding durch die Anwesenheit von Wolbachia nicht kompromittiert wird.

Der dritte Mechanismus ist der Genfluss über Artgrenzen hinweg. Ähnliche Muster offensichtlicher interspezifischer mitochondrialer Introgression sind bei Schwesterarten beschrieben worden. Wer mit mitochondrialen Barcodes arbeitet, muss diese drei Möglichkeiten mitdenken.

Am Ende zählt, was von den ursprünglichen Zusagen tatsächlich eingetreten ist. Sortiert man sie nach ihrem Erfüllungsgrad, entstehen drei Gruppen: eingelöst, eingeschränkt, offen.

Eingelöst ist der Kern des Versprechens. In den meisten Tiergruppen stimmen die Cluster der Barcode-Sequenzen und die bekannten Arten ausgezeichnet überein. Diese Passung zwischen taxonomischem Rahmen und den Sprungstellen im COI-Abschnitt lässt die Methode sowohl beim Entdecken als auch beim Bestimmen von Arten sehr wirksam arbeiten.

An manchen Stellen geht der Befund sogar über das Versprochene hinaus: Hochrechnungen aus den Barcode-Daten deuten auf mindestens 94 000 Insektenarten in Kanada hin, fast eine Verdopplung der zuvor geschätzten 54 000 Arten. Wie aber sieht es dort aus, wo die klassische Taxonomie ohnehin gründlich gearbeitet hat? Barcoding-Studien an nahezu 5000 europäischen Käferarten förderten nur wenige übersehene Arten zutage, was dafür spricht, dass das taxonomische System der Käfer robust ist. Auch die Trefferquote selbst hat Grenzen: Wurden Unbekannte gegen einen Stammbaum aus Vertretern aller traditionellen Arten abgeglichen, saß die Zuordnung in 80 Prozent der Fälle richtig. Auch dort, wo der Barcode etwas findet, folgt die taxonomische Arbeit nicht automatisch: kryptische Arten, die aus DNA-Barcodes hervorgehen, werden nicht immer von taxonomischer Revisionsarbeit begleitet.

Offen bleiben zwei Punkte, und beide sind grundsätzlicher Natur. Der erste betrifft die Prüfbarkeit selbst: Ohne ein unabhängiges Kriterium zur Bestätigung gibt es kein Mittel, um zu beurteilen, was funktioniert und was nicht. Feste Prozentschwellen zur Artabgrenzung haben sich dabei nicht bewährt und werden ausdrücklich nicht empfohlen. Sie taugen allenfalls dazu, stark abweichende neue Taxa aufzuspüren, und übersehen dabei mindestens ein Fünftel der Lebensformen.

Der zweite Punkt ist praktischer Natur: Die größte Hürde bleibt die Vervollständigung der Referenzdatenbank für die deutsche Fauna und Flora. Fehlt diese Grundlage, erzeugen die meisten Anwendungen unvollständige Artenlisten. Hohe Genauigkeit im weltweiten Maßstab ist deshalb erst zu erwarten, wenn die Mehrzahl der evolutionären Einheiten erfasst und taxonomisch bewertet ist.