Was der Blick ins Erbgut über Pflanzen in Lebensmitteln verrät – und wo er aufhört

Ein Kräutertee ist ein Vertrauensgeschäft: Die Lebensmittel, die wir täglich zu uns nehmen, werden an einem uns unbekannten Ort aus Rohstoffen hergestellt, die wir nie zu Gesicht bekommen. Hersteller sind deshalb gesetzlich verpflichtet, ihre Produkte mit Angaben zum Inhalt zu kennzeichnen. Zu den allgemeinen Zielen des europäischen Lebensmittelrechts gehört das Recht der Verbraucher auf sichere Lebensmittel und auf genaue und ehrliche Information.

Schon beim Namen auf der Packung beginnt allerdings die Unschärfe. Auf Etiketten stehen keine wissenschaftlichen Artnamen, sondern volkstümliche Bezeichnungen, die wissenschaftlich ungenau und anfällig für Missverständnisse sind. Der gebräuchliche Name „Lemon Myrtle“ etwa deckt zwei völlig verschiedene Arten ab, Backhousia citriodora und Leptospermum citratum. Die beiden unterscheiden sich nicht nur in ihren sekundären Inhaltsstoffen, sondern auch in ihrer dosisabhängigen Giftigkeit.

Man könnte nun erwarten, dass ein Blick auf die Pflanze die Frage klärt. Doch eine Bestimmung allein nach dem Aussehen kann danebengehen, wenn eine Art unterschiedliche Erscheinungsformen ausbildet oder wenn es sich um kryptische, morphologisch nicht unterscheidbare Arten handelt. Je nach Umweltbedingungen kann ein einzelnes Exemplar sehr verschieden von einem anderen Exemplar derselben Art aussehen.

Mit der Verarbeitung verschwindet auch noch der Rest. Werden Pflanzenteile zu Pulver oder ähnlichen Formen verarbeitet, verdeckt das genau jene morphologischen Merkmale, auf die eine Bestimmung angewiesen wäre. Übrig bleibt die eigentliche Aufgabe: winzige Bruchstücke abgestorbenen Pflanzengewebes zu bestimmen, wie sie in den meisten verarbeiteten Lebensmitteln vorliegen.

Diese Lücke bleibt nicht ungenutzt. In der Kräuterproduktbranche entstehen Sicherheitsprobleme durch den absichtlichen Einsatz von Verfälschungsmitteln und die Beimischung nicht deklarierter Füllstoffe. Angetrieben wird das von einem steigenden Verbrauch, der bei manchen Pflanzenarten die verfügbare Menge übersteigt.

Wie hoch der Druck auf die Analytik ist, zeigt ein anderes Beispiel: Honig gilt weltweit als eines der häufigsten verfälschten Lebensmittel. Bei einer von der Europäischen Kommission koordinierten Maßnahme wurden 2021/2022 Honigproben an EU-Grenzen gezogen, und von 320 Proben wurden 46 Prozent als verdächtig bezüglich eines Zusatzes von Zuckersirup bewertet.

Verfahren, die auf Aussehen oder chemisches Profil setzen, versagen genau dann, wenn die morphologischen Merkmale verloren gegangen sind.

Wer wissen will, welche Pflanze in einer getrockneten Kräutermischung steckt, hat es schwer: Am zuverlässigsten ließ sich eine solche Mischprobe bisher unter dem Mikroskop prüfen. Für die meisten der neu eingeführten Arten fehlen die dafür nötigen Beschreibungen jedoch vollständig. Der genetische Weg umgeht dieses Problem, indem er nicht die Pflanze ansieht, sondern ihr Erbgut liest.

Der erste ist die Polymerase-Kettenreaktion, kurz PCR: Sie dient der Vervielfältigung eines DNA-Abschnittes, und zwar in Zyklen mit jeweils drei Schritten. Zunächst trennt die Denaturierung die Doppelstränge der DNA voneinander. Danach lagern sich die Primer an, kurze DNA-Stücke, die eigens für den zu vervielfältigenden Abschnitt entworfen werden und ihn flankieren, also links und rechts einrahmen. Diese Technik gilt als sehr robust und kommt mit erstaunlich wenig Ausgangsmaterial aus, denn sie vervielfältigt DNA-Stücke schon aus wenigen Kopien des Zielbereichs.

Kopiert wird dabei nicht das ganze Erbgut, sondern nur ein kurzer, ausgewählter Ausschnitt davon. Genau darauf beruht das DNA-Barcoding: auf Sequenzunterschieden in kurzen, standardisierten Genabschnitten taxonomisch vordefinierter Gruppen. Die Buchstabenfolge aus einer unbekannten Probe vergleicht anschließend ein Rechenverfahren mit einer Referenzdatenbank, in der Sequenzen mit bekannter taxonomischer Zuordnung hinterlegt sind. Das funktioniert nur unter einer Annahme: dass die genetischen Unterschiede innerhalb einer Art kleiner ausfallen als die zwischen zwei Arten. Ein tauglicher Barcode-Abschnitt muss deshalb auf Artebene genügend Unterschiede tragen, und zugleich müssen seine Randbereiche über viele Arten hinweg gleich bleiben, damit dort universelle PCR-Primer ansetzen können.

Für Pflanzen fiel die Wahl auf rbcL: Hinter dem Kürzel steckt ein Teilstück des Gens für die große Untereinheit der Ribulose-bisphosphat-Carboxylase, vorgeschlagen als einer der zentralen molekularen Marker für das genetische Barcoding von Pflanzen.

Bleibt die Auswertung. Das Verfahren PCR-RFLP beruht auf unterschiedlichen Restriktionsmustern eines Markers. Praktisch heißt das: Auf die PCR folgt ein Verdau, der das Kopierprodukt an bestimmten Stellen zerschneidet, danach werden die Bruchstücke elektrophoretisch aufgetrennt, und das dabei entstehende künstliche Muster lässt verschiedene taxonomische Gruppen auseinanderhalten. So werden schon Unterschiede einzelner DNA-Buchstaben im Markerbereich sichtbar, sogenannte Einzelnukleotid-Polymorphismen.

Eine Grenze war dabei von Beginn an eingebaut: Als Standard-Barcode für Pflanzen schlug die Plant Working Group des Barcoding-Konsortiums CBOL das Paar rbcL + matK vor — mit einer Unterscheidungsleistung von rund 70 Prozent. Wie zuverlässig ein Barcode Arten trennt, unterscheidet sich zudem von Pflanzengruppe zu Pflanzengruppe. Um die Trennschärfe zu erhöhen, werden deshalb verschiedene Kombinationen plastidärer und nukleärer Marker als ergänzende Marker eingesetzt.

Bevor sich Pflanzen in einem verarbeiteten Produkt anhand ihres Erbguts bestimmen lassen, steht eine unscheinbare Vorfrage im Weg. Übersteht die DNA die Verarbeitung überhaupt in brauchbarem Zustand? Wo Hitze und ein saures Milieu zusammenkommen, lässt das die DNA irreversibel hydrolysieren, sie zerfällt also unwiederbringlich in kurze Stücke. Gerade bei der Extraktion aus prozessiertem Pflanzenmaterial ist mit hoher DNA-Fragmentierung zu rechnen. Neben dieser Zerstückelung gilt als zweite Hürde, dass sekundäre Pflanzenstoffe die DNA-Polymerase hemmen, also jenes Enzym, das die Kopierarbeit im Labor erledigt.

Genau diesen Effekt hat die Untersuchung nicht abgeschätzt, sondern im Labor nachgestellt. Die Proben wurden dafür in einem Ultraschall-Wasserbad behandelt, und zwar für 6, 30 und 60 Sekunden sowie für 5, 10, 50 und 100 Minuten. Als Prüfstein wurden zwei unterschiedliche Marker ausgewählt, also festgelegte Abschnitte des Erbguts, die man in der PCR gezielt vervielfältigt. Der eine war der offizielle Barcoding-Marker rbcLa mit einem Fragment von rund 600 Basenpaaren, der andere das deutlich kürzere ITS2 aus dem Zellkern mit rund 300 Basenpaaren.

Schon 6 bis 30 Sekunden im Bad reichten, um den Großteil der genomischen DNA zu zerstören, im Gel war danach keine klare Bande mehr zu erkennen. Trotzdem ergab jede einzelne dieser Behandlungen eine gute Vervielfältigung des Markers. Erst als die Hauptmenge der Bruchstücke unter die Größe des rbcLa-Fragments von rund 600 Basenpaaren rutschte, brach die Reaktion deutlich ein. Ultraschall erzeugt vor allem Doppelstrangbrüche, die den Erfolg der Vervielfältigung nicht beeinträchtigen, solange der Bruch nicht in der gesuchten Region liegt. Und selbst wenn die Hauptmenge zu klein geworden ist, bleibt eine kleine, unentdeckte Population ausreichend langer Fragmente übrig.

Der Kernbefund lautet, dass selbst bei starker Fragmentierung eine Amplifikation der Marker möglich ist, solange sich eine ausreichende Menge reiner DNA gewinnen lässt. Damit stellt sich die Frage nach der eigentlichen Ursache neu. Extraktionen aus getrocknetem oder anders verarbeitetem Material ergaben regelmäßig stark fragmentierte DNA und anschließendes Versagen der PCR, während dieselbe Analyse mit frischem Material gelang. Das Versagen ging deshalb wahrscheinlich auf sekundäre Pflanzenstoffe zurück und nicht auf die Fragmentierung.

‚Lemon Myrtle‘ wird in Europa immer beliebter, in der Küche wie in der Pflanzenheilkunde. Der Name klingt nach einer einzigen Pflanze, steht aber für zwei verschiedene Arten aus der Familie der Myrtengewächse: Backhousia citriodora und Leptospermum citratum. Beide stammen aus dem Nordwesten Australiens, wachsen als Sträucher oder kleine Bäume und sind reich an aromatischen Ölen. Verkauft werden sie vor allem als Tee, meist in Mischungen.

Die beiden Arten unterscheiden sich in ihren Sekundärstoffen und können bei Verwechslung und hoher Dosis giftig wirken. Gesucht war deshalb ein einfacher Test, der die beiden Arten sicher auseinanderhält — auch in getrockneten, stark zerkleinerten Mischungen, wie sie im Handel üblich sind.

Die Untersuchung verband die herkömmliche mikroskopische Analyse mit einer molekularen Bestimmung. Als genetisches Erkennungszeichen diente der Erbgut-Abschnitt rbcL, den ein internationales Konsortium gemeinsam mit dem Abschnitt matK als Kennung für den genetischen Strichcode von Pflanzen vorgeschlagen hat. Beim Vergleich der Sequenzdaten beider Arten fand sich ein Unterschied in den Restriktionsstellen — und damit die Möglichkeit, einen PCR-RFLP-Test zu entwerfen. Ins Visier genommen wurde eine Schnittstelle des Enzyms Sac II, die sich zwischen den beiden Arten unterscheidet. Die Vorhersage lautete: Bei L. citratum zerfällt das vervielfältigte Stück in zwei Fragmente von 458 und 141 Basenpaaren, während bei B. citriodora das ursprüngliche, 599 Basenpaare lange Produkt unversehrt bleibt. Der Versuch bestätigte das: Bei L. citratum entstanden ein größeres Fragment von rund 450 und ein kleineres von rund 150 Basenpaaren. Geprüft wurde der Test zuerst an Referenzpflanzen und danach an Erzeugnissen aus dem Handel.

Doch damit ist die Geschichte nicht zu Ende. Manchen Proben ist Dracocephalum moldavica beigemischt, eine Pflanze mit ähnlichem Zitrusaroma. Ihr Schnittmuster glich dem von L. citratum. Liegt sie mit im Gefäß, behindert das Muster die Unterscheidung zwischen Backhousia citriodora und Leptospermum citratum. In solchen Fällen muss die Restriktionsanalyse durch eine weitere Untersuchung ergänzt werden. Das kann eine mikroskopische Prüfung sein oder, wenn anatomische Merkmale durch starke Verarbeitung verloren gegangen sind, ein zusätzlicher molekularer Marker. Hinzu kommt ein praktischer Nachteil des RFLP-Ansatzes: Er braucht ein zweiphasiges Protokoll, weil auf die PCR erst noch der Verdau mit dem Enzym folgen muss.

Der taxonomische Unterschied — es sind zwei verschiedene Gattungen — und die chemische Zusammensetzung verlangen nach einer besseren Kennzeichnung der jeweiligen Erzeugnisse.

Der Moldawische Drachenkopf findet als Tee Verwendung, und genau dort wurde er zum Prüffall. In einer ersten Phase nutzte die Arbeitsgruppe PCR-RFLP, um Verwechslungskandidaten wie Melisse und Katzenminze in entsprechenden Produkten aufzuspüren. Das Verfahren macht sich einen winzigen Unterschied zunutze: einen Austausch von G nach T an Position 442 des rbcLa-Abschnitts.

Mit dem Enzym BamH I lässt sich Drachenkopf dadurch klar von Beimischungen unterscheiden. Doch darin steckt eine logische Falle. Misslingt der Verdau, also der Schneideschritt nach der Vervielfältigung, bliebe eine Verfälschung unbemerkt. Die Gegenvariante mit dem Enzym EcoR I dreht das Problem nur um: Der Nachweis des Drachenkopfs ist dort gegen ein Versagen des Verdaus abgesichert, doch dasselbe Bandenmuster ergäbe sich auch bei einer Beimischung von Melisse.

Die Antwort darauf war ein anderes Verfahren: Zum ersten Mal wurde hier das Amplified Refractory Mutation System, kurz ARMS, für einen diagnostischen Primer angewendet. Der Kniff steckt in einem Zwischenprimer, der neben dem vollständigen Fragment eine zweite, kleinere Bande erzeugt. Weicht die Zielsequenz ab, bleibt diese Nebenbande aus; so würde jede Beimischung mit auch nur kleinen Änderungen im Zielmotiv auffallen. Zugleich prüft sich der Test selbst: Ein Versagen der Vervielfältigung würde sofort bemerkt. Das vollständige Band meldet damit in einem Zug zweierlei — dass die PCR gelungen ist und dass Drachenkopf in der Probe steckt. Anders als PCR-RFLP erlaubt dieser Ansatz den direkten Nachweis ohne zusätzlichen Verdau. RFLP dagegen verlangt ein zweistufiges Vorgehen, bei dem das Vervielfältigte über Nacht verdaut werden muss. Universelle Primer als Positivkontrolle erhöhen zusätzlich die Robustheit der Methode.

Eine Grenze aber bleibt, und sie gilt für beide Verfahren gleichermaßen. Sowohl ARMS als auch RFLP prüfen gezielt auf bestimmte Arten und setzen damit eine Vermutung darüber voraus, womit überhaupt gepanscht wird. Nötig sind dazu auch Sequenzdaten der infrage kommenden Beimischungen. Und liegt mehr als eine Verfälschung vor, werden die Befunde komplex.

Verwechslungen von Produktkomponenten können fatale medizinische Folgen haben. Pflanzenmaterial aus der Familie der Aristolochiaceae enthält Aristolochiasäuren, und wenn es in traditionelle Heilmittel gerät, löst es die Aristolochiasäure-Nephropathie aus, eine Erkrankung der Nieren. Wie folgenreich das sein kann, zeigt ein Vorfall aus Belgien: Dort verloren mehr als 100 Frauen nach einer Schlankheitskur auf Grundlage der Traditionellen Chinesischen Medizin ihre Nieren. Verschrieben worden war ihnen zum Abnehmen die Droge Fangji, verwendet wurde stattdessen das aristolochiasäurehaltige Guangfangji. In der Folge entwickelten die Frauen eine Vernarbung des Nierengewebes und Tumoren der oberen Harnwege. Erledigt ist die Sache nicht: Etwa 256 traditionelle chinesische Fertigarzneimittel mit Material aus dieser Pflanzenfamilie werden auf chinesischen Märkten weiterhin verkauft.

Horns eigene Fallstudie setzt bei einem anderen Präparat an: Sie widmet sich einer Aristolochia-Art, die in der Literatur als Verwechslungsart des pharmazeutischen Produkts Clematidis Armandii Caulis erwähnt wird; angestrebt war ein Marker, der das Vorhandensein von Aristolochia manshuriensis anzeigt. Entwickelt wurde dieser spezifische Marker mit einem Verfahren namens RAPD, kurz für „Random Amplified Polymorphic DNA“ — DNA-Abschnitte werden dabei also zufällig vervielfältigt, statt eine vorher bekannte Genstelle gezielt zu lesen. Elf solcher Primer (50a bis 50k) kamen zum Einsatz und erzeugten für acht Pflanzenproben je ein Streifenmuster, einen genetischen Fingerabdruck. Die Ausbeute war mager: Eine Probe einer Ersatzart lieferte überhaupt kein Muster, und die meisten Muster fielen sehr einfach und teilweise nur schwach vervielfältigt aus. Fragmente, die nur bei der Verwechslungsprobe auftraten, wurden aus dem Gel herausgelöst; das eindeutig wieder vervielfältigte Fragment des Primers 50e wurde sequenziert. Auf dieser Sequenz baute ein Primerpaar auf, das ein 629 Basenpaare langes, nur für die Verwechslungsprobe typisches Fragment liefert. An allen verfügbaren Proben getestet, zeigte es genau diese Spezifität.

Und hier kommt die Einschränkung. Die Spezifität des Markers ließ sich anhand der verwendeten Akzessionen zeigen, also der Pflanzenproben, die im Labor vorlagen; eine ausreichend robuste Validierung der Art- beziehungsweise Gattungsspezifität konnte aufgrund fehlender Referenzpflanzen nicht durchgeführt werden. Ausreichend korrekt identifizierte Referenzpflanzen sind eine grundlegende Voraussetzung dieser Arbeit. Der Befund bleibt damit offen.

Ein genetischer Test vergleicht, und er braucht dafür Pflanzen, deren Art zweifelsfrei feststeht: Ausreichend korrekt identifizierte Referenzpflanzen sind eine grundlegende Voraussetzung der untersuchten Arbeit. Wie eine solche Vergleichsbasis entsteht, lässt sich an der alltäglichen Gartenarbeit hinter den Tests ablesen.

Für den Vergleich zweier verwechselbarer Teepflanzen wurden die Exemplare im Botanischen Garten des Karlsruher Instituts für Technologie parallel unter identischen Bedingungen kultiviert, weil die Gestalt einer Pflanze von Umweltfaktoren wie Menge und Qualität des Lichts abhängt. Gekauft wurden sie bei einem kommerziellen Anbieter, und ihre Identität wurde anhand der Blüten- und Blattmerkmale überprüft. Die Sammlung des Gartens selbst wanderte von einer Excel-Liste in ein Online-Datenbanksystem, und für die Verwaltung wurde eine interaktive Datenbank-Anwendung erstellt. Sie sollte eine konsistente Datengrundlage schaffen und eine gemeinsame Verwaltung zulassen. Der Namensstatus jedes lokalen Pflanzenbestands wurde nach einer öffentlichen Artenliste vermerkt, und zwar als anerkannt, als Synonym, als ungeklärt oder als unbekannt.

Bei Produkten aus exotischen Pflanzenarten kommt zu den taxonomischen Fragen eine begrenzte Verfügbarkeit von Referenzmaterial hinzu. Beim Durchsehen von 79 Saatgutkatalogen europäischer botanischer Gärten im Jahr 2012 fanden sich Akzessionen, also dokumentierte Sammlungszugänge, für nur zehn Arten der Gattung Dracocephalum. Beschrieben sind von dieser Gattung etwa 70 Arten. Bei vier der gefundenen Bestände war eine Wildherkunft bekannt, alle übrigen waren unbekannter Herkunft und in den jeweiligen Gärten kultiviert. Den Wert solchen Materials mindert außerdem die lange Kultur in botanischen Gärten, und es fehlen Angaben zur geografischen Herkunft der natürlichen Population. Für einen Marker, der eine Art der Gattung Aristolochia erkennen sollte, konnte eine ausreichend robuste Validierung wegen fehlender Referenzpflanzen nicht durchgeführt werden.

Und wie steht es um die öffentlichen Sequenzdatenbanken, in denen solche Vergleichsdaten landen? Drei selbst gewonnene Sequenzen wichen deutlich von einem in GenBank hinterlegten Eintrag ab, zu dem keine Angaben zu Identität oder Belegexemplaren berichtet worden waren. In einer anderen Untersuchung wurden alle Belegexemplare im Herbarium des Instituts aufbewahrt. Falsch-positive Artbefunde ließen sich unter anderem auf fehlerhafte Abschnitte der Pflanzen-Genomsequenzen in den Datenbanken zurückführen. Weil derzeit nur etwa 2000 Genomsequenzen von Pflanzenarten verfügbar sind, ist die Auflösung der Methodik zudem noch limitiert. Unvollständige Referenzdatenbanken können dazu führen, dass eine tatsächlich vorhandene Art nicht erkannt wird. Empfohlen wird deshalb der Einsatz von Referenzstandards als Positivkontrolle für DNA-Extraktion und PCR.

Warum lässt sich eine Kräutermischung nicht ohne Weiteres in einem Zug entschlüsseln? Das klassische DNA-Barcoding beruht darauf, dass kurze, standardisierte Abschnitte des Erbguts sich zwischen Gruppen unterscheiden. In der Praxis taugt es nur für die Prüfung von Präparaten mit einer einzigen Zutat, und nur für unverarbeitetes Pflanzenmaterial. Verarbeitungsschritte führen in der Regel zu Verlust, Abbau oder Vermischung der DNA.

Was heute hinzukommt, ist der Durchsatz. Hochdurchsatzplattformen folgen typischerweise demselben Muster: Templatepräparation, klonale Amplifikation, gefolgt von mehreren Zyklen massiver Parallelsequenzierung. Solche Verfahren gelten als kostengünstiger, effektiver und schneller in der Speziesidentifikation. Verbindet man sie mit dem Barcoding-Prinzip, entsteht das DNA-Metabarcoding, das viele Arten einer Probe gleichzeitig bestimmt. Was dabei herauskommt, zeigt eine Untersuchung, die fünfzehn Handelsprodukte mit DNA-Metabarcoding und zwei Barcode-Regionen analysierte. Im Mittel wurden 70 Prozent der deklarierten Zutaten nachgewiesen, je nach Produkt zwischen 44 und 100 Prozent. Zielgerichtete Anreicherungssequenzierung und Genome Skimming steigern die Auflösung der Artbestimmung in schwierigen Pflanzengruppen zusätzlich erheblich.

Geblieben ist die Mühe mit dem Rest. Bei nah verwandten Taxa ist eine Auflösung auf Art-Niveau nicht immer möglich und oft auf die Gattung beschränkt. Aus den Ergebnissen lassen sich außerdem keine Mengen ablesen: Von relativen Verhältnissen kompositioneller Datensätze kann man nicht auf absolute Mengen in einer Probe schließen. Fehlt eine Art im Befund, kann das auch an der fehlenden Zuordnung wegen unvollständiger Datenbankeinträge liegen. Ebenso beschränkend wirken die Verfügbarkeit authentischer, überprüfter Referenzsequenzen, geeigneter Klassifizierprogramme und universell anwendbarer Barcoding-Primer. Und die offiziellen Barcodes der Sequenzdatenbank BOLD sind matK und rbcL; ein Konsens über den besten pflanzlichen Barcode oder eine Kombination mehrerer Barcodes muss erst noch gefunden werden.

Was heißt das für die amtliche Beurteilung? Eine deutsche Arbeitsgruppe zur NGS-Speziesidentifizierung hat dazu eine zweite Stellungnahme vorgelegt. Als übergeordnetes, alleiniges Qualitätsmerkmal für alle Honige hält sie NGS-Methoden derzeit aufgrund ihrer inhärenten Limitationen für ungeeignet. Nutzen lassen sich Metabarcoding und Metagenomics zurzeit nur in vergleichender Kombination mit der standardisierten mikroskopischen Pollenanalyse.